芪丹颗粒剂治疗大鼠实验性矽肺的形态学观察.doc

1 芪丹颗粒剂治疗大鼠实验性矽肺的形态学观察 辛洪涛，张华楠，张维东 【摘要】 目的 探讨芪丹颗粒剂抗矽肺纤维化作用。方法 60只Wistar大鼠随机分为六个 组：正常对照组、模型组、芪丹1组、芪丹2组、汉甲1组、汉甲2组。除正常对照组外，其 余各组采用气管注射染尘（50mg/鼠）方法建立动物模型，芪丹 1组和汉甲1组分别从造模 后第2天灌注芪丹颗粒剂（3125mg/kg）和汉防己甲素( Tetrandrine ,Tet)（22mg/kg ） ；芪丹2 组和汉甲2组分别从造模30天后灌注芪丹颗粒剂和汉防己甲素（用量同前） ，5个月后处死。 测定各组大鼠肺脏器系数及羟脯氨酸含量，同时对肺组织作HE染色、VG 染色和网状纤维 染色（Gomorri） ，普通光镜下观察各组矽结节的细胞构成，胶原纤维及网状纤维改变；同 时取肾组织作HE染色，普通光镜下观察肾脏病理改变。 结果 芪丹组、汉甲组的肺系数、 羟脯氨酸含量均低于模型组，差异有显著性（P＜0.05） 。模型组主要以Ⅲ～Ⅳ级矽结节为 主，胶原纤维粗大、排列致密，网织纤维稀疏，芪丹颗粒及汉防己甲素治疗组主要以Ⅱ级 矽结节为主，胶原纤维细小、排列疏松，网织纤维密集；汉甲组大鼠出现肾损伤，其余各 组大鼠肾组织正常。结论 芪丹颗粒剂有延缓和减轻矽肺纤维化的作用，与汉防己甲素比 较无明显差异，但无肾毒性。 【关键词】 芪丹颗粒剂；矽肺鼠；肺脏器系 1数；羟脯氨酸含量；病理学观察 Effects of Qidan granule on Pathological Observation of Experimental Silicosis 【Abstract】 Objective To studay the anti-fibrotic effects of Qidan granule in rats. Methods The rats were randomly divided into six experimental groups: normal group, model group, Qidan group one, Qidan group two, Tetrandrine group one and tetrandrine group two. All the rats except normal group were treated with silicon dioxide (50mg/rat) by intratracheal instillation to induce silicosis. Qidan group and Tetrandrine group were treated with Qidan granule(3125mg/kg)or treated with Tetrandrine (22mg/kg)respectively . All the rats were sacrified after 5 months.Lung/body coefficient and were measured. Paraffinembedded lung sections with HE staining、VG staining and Gomorri staining was observed under light microscop. Results In Qidan group and Tetrandrine group ,the Lung/body coefficient and content of Hydroxyproline is lower compared with model group(P0.05). Model group was mainly Ⅲ～Ⅳ grade silicotic nodule,which contained thick collagen and sparse reticulum fibe; Qidan group and Tetrandrine group were mainly Ⅱgrade silicotic nodule, which contained tiny collagen and intensive reticulum fibe. Tetrandrine group showed up injury of kidney, others were normal. Conclusion Qidan granule extract inhibited and reduced remarkably silicotic fibrosis in rats. 基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472203#） 辛洪涛，山东省立医院呼吸内科, 山东大学博导,通讯作者. E-mail: xinhongtao168@yahoo.com.cn 张华楠（山东大学博士研究生） ，山东大学山东省立医院呼吸内科，250021 张维东，山东省医学科学院. 2 【Key Words】 Qian granule, Experimental Silicosis, Lung/body coefficient,content of Hdroxyproline,Pathologic observation 目前，国内外矽肺患者众多，汉防己甲素等传统治疗矽肺的药物因其价格高，副作用大， 不能被临床所广泛应用。为了寻找治疗矽肺的理想药物，我们采用纯中药制剂芪丹颗粒剂 （主要成分有丹参、黄芪、川芎等）试验性治疗大鼠矽肺，观察治疗后大鼠的肺系数及羟 脯氨酸含量的变化及肺脏的病理形态学改变，旨在探讨芪丹颗粒剂对矽肺鼠的疗效及作用 机制。 1、 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器：二氧化硅粉尘系 Sigma 公司产品，用生理盐水稀释成 50mg/ml 悬浊 液，游离二氧化硅含量≥99%,＜5μm 的粒子≥99% ，使用前高压灭菌，按 8000u/ml 加 入青霉素；芪丹颗粒剂是由黄芪、丹参、川芎等中草药加工提纯后的粗提取物制成的 颗粒剂，每包 10g(1g 干粉相当于原生药 8g)，山东省立医院制剂室产品；汉防己甲素 购于杭州斯沃尔工贸有限公司，使用前用 0.2%的稀盐酸溶解；羟脯氨酸试剂盒购于南 京建成生物研究所。 1.2 动物模型及分组：选健康 SPF 级 Wistar 大鼠 60 只，体重 (180±20)g,由山东大学实验 动物中心提供，按 SPF 标准喂养。随机分为正常组、模型组、汉甲组（汉甲 1 组、汉 甲 2 组） 、芪丹组（芪丹 1 组、芪丹 2 组） 。用 2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)腹腔内注射 麻醉,用带接头硬膜外麻醉导管插入气管。10 只大鼠经气管内一次性灌注生理盐水 1ml 作为正常对照；另 50 只经气管内一次性灌注 50mg/ml 二氧化硅粉尘悬浊液（使用前按 8000U/ml 加入青霉素）1ml 和 0.25ml 空气。注入后立即旋转动物，使药液在肺内分布 均匀。随机取 10 只为模型组。从造模次日开始，芪丹 1 组每天用芪丹颗粒剂灌胃 （3125mg/kg） ；汉甲 1 组每周六天用汉防己甲素灌胃（22mg/kg） ；正常对照组每天用 生理盐水灌胃（2ml/只） 。从造模 31 日开始，芪丹 2 组每天用芪丹颗粒灌胃 （3125mg/kg） ；汉甲 2 组每周六天用汉防己甲素灌胃（22mg/kg） 。汉甲组用药 3 个月 后停药一个月（因其有较强的肾毒性） 。 1.3 观察指标及测定方法：造模5个月后处死大鼠，处死前称取大鼠体重；1%戊巴比妥纳 (35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出肺组织及左肾。将取出的肺组织剔除气管、支气管 管等结缔组织, 在生理盐水内漂洗一次, 用滤纸吸干水分,称取肺湿重，计算肺脏器系 数，肺脏器系数=大鼠肺湿重（mg）/大鼠体重（g） ；取肺左叶剪掉肺尖和肺底, 将中 间大部用10 %中性缓冲福尔马林液固定, 石蜡包埋, 切片厚度5μm。连续切片，采用 苏木素-伊红（HE ）染色、苦味酸-酸性品红法（Van Gieson,VG）染色和网状纤维染 色（Gomorri） ，普通光镜下观察各组矽结节的细胞构成，胶原纤维及网状纤维改变。 取肺右尖叶用碱水解法（按羟脯氨酸试剂盒说明书）测定羟脯氨酸含量。其余肺组织 液氮保存。取左肾用10 %中性缓冲福尔马林液固定, 石蜡包埋, 切片厚度5μm，HE 染 色，普通光镜下观察肾组织病理改变。 1.4 统计方法 所有数值均用 ±s 表示, :利用SPSS11.5 统计软件,各组间比较用单因素方差分析。x 2．结果 2.1 大鼠肺脏器系数及羟脯氨酸含量：表 1 可见，正常组、芪丹 1 组、芪丹 2 组、汉甲 1 组、汉甲 2 组的肺系数、羟脯氨酸含量均低于模型组，差异有显著性（P＜0.05） ；芪丹 1 组、芪丹 2 组、汉甲 1 组、汉甲 2 组的肺系数高于正常组，差异有显著性（P＜0.05） ，各 治疗组羟脯氨酸含量与正常组无差异显著性。 3 表1 各组大鼠肺脏器系数和羟脯氨酸含量（ ±s）x 组别 例数 肺系数 羟脯氨酸含量（mg/g） 正常组 10 3.61±0.38△ 1.89 ±0.27△ 模型组 10 13.27±2.19* 3.90±1.46* 芪丹1组 10 5.61±1.11*△ 2.20±0.26 △ 芪丹2组 10 5.82±1.06*△ 2.61±0.50 △ 汉甲1组 10 5.91±1.13*△ 2.67±0.56 △ 汉甲2组 10 5.94±1.05*△ 2.66±0.47 △ 与正常组比较， *P＜0.05；与模型组比较， △ P＜0.05 2.2 肺病理学检查： ⑴大体观察：正常组大鼠双肺程淡粉色，表面光滑，无异常改变；模型组大鼠双肺体积增 大、增重，质硬，肺表面及切面可见大量粟粒大小的灰白色结节，并大量融合，质地硬， 突出肺表面；芪丹颗粒及汉防己甲素治疗组可见肺散在点状、小灶状出血，偶见散在粟粒 大小的灰白色结节，未突出肺表面，无融合现象。 ⑵光镜观察： HE染色结果：按照实验性矽肺四级分类法 〔1〕 ，将矽肺分为四级:0级，未发生病变；Ⅰ级， 细胞性结节；Ⅱ级，细胞纤维性结节；Ⅲ级，纤维细胞性结节；Ⅳ级，纤维性矽结节,并可 见部分结节融合。 正常组镜检未见明显形态学改变；模型组大鼠肺组织结构破坏，肺泡萎陷，纤维组织明显 增生，小血管及细支气管周围尤为明显。可见肺组织中形成大量的大小不等的矽结节，主 要以Ⅲ～Ⅳ级矽结节为主，部分融合成片，结节中央大量胶原纤维增生，少数可见玻璃样 变，成纤维细胞、巨噬细胞较少，主要分布在结节周边，VG染色可见其粗大的胶原纤维分 布，排列致密，网状纤维染色（Gomorri）可见纤细的网织纤维稀疏的分布在矽结节周边； 芪丹颗粒及汉防己甲素治疗组大鼠主要以Ⅱ级矽结节为主，HE染色可见散在分布的矽结节， 没有融合，结节主要由成纤维细胞、巨噬细胞和胶原纤维组成，VG染色可见细小、排列疏 松的胶原纤维，网状纤维染色（Gomorri）可见纤细的网织纤维密集的分布在结节中央及周 边。 表2 各组大鼠肺的病理分级（%） 病变分级组别 例数 Ⅱ Ⅱ～Ⅲ Ⅲ～Ⅳ 正常组 10 0 0 0 模型组 10 0 28.5 71.5 芪丹1组 10 75.1 24.9 0 芪丹2组 10 66.7 33.3 0 汉甲1组 10 71.4 28.6 0 汉甲2组 10 72.7 27.3 0 2.3 肾病理学检查：光镜观察：正常组、模型组、芪丹组未见明显病变；汉甲组可见肾小 管上皮细胞明显肿胀、变性，部分出现颗粒样变性、少数出现空泡变性，肾间质有炎细胞 浸润，肾小球鲍氏囊中可见淡红色均质状蛋白性渗出物。 4 2.5 讨论 矽肺是由于长期吸入游离二氧化硅粉尘所引起的以肺部弥漫性纤维化为主的疾病，其发 病机制是机体对吸入的二氧化硅粒子产生的一系列复杂的细胞、炎症、免疫反应的结果,主 要病理变化为胶原过量合成导致的肺组织纤维化，目前国内外尚无有效治疗方法。汉防己 甲素是从防己的块根中提取而得，已被国内外众多学者证实能够抑制TNFα释放 〔2〕 、抑制 胶原蛋白的合成 〔3〕 ，具有治疗矽肺的作用 〔4〕 ，但因其价格昂贵、肾毒性大，未获得临床 上广泛应用。 应用中医中药治疗矽肺也已应是一条新的途径，从中医的角度讲，中医辨证治疗本病以 气虚(进行性呼吸困难、活动后加重或伴汗出) 、阴虚(干咳、痰少、咽干、口渴) 、痰热瘀 阻(胸中窒闷，不得喘息，胸痛、低热、发绀、舌质暗红、或有瘀斑、脉细数或滑数，肺部 爆裂音或哮鸣音) 为主要病机。故本病的中医治则应以益气养阴，清热、活血化瘀，止咳 化痰为主。通过大量的对特定中药的药理及所含成分的研究，观察到中药丹参可减少氧自 由基的产生，保护血管内皮细胞，改善微循环和细胞出血、缺氧所至的代谢障碍，可明显 抑制成纤维细胞的生成和繁殖，同时可增强机体免疫力。黄芪可促进机体非特异性免疫和 细胞免疫功能，还有抗细菌、抗病毒作用及抗衰老作用和抗疲劳作用；赵俭 〔5〕 在川芎嗪 对博来霉素所致大鼠肺纤维化的保护作用发现肺纤维化的形成过程中,自由基损伤机制很重 要,川芎嗪可直接清除具细胞毒性作用的自由基,还具有抑制成纤维细胞分裂、增殖的作用, 从而起到抗组织损伤和防治肺纤维化作用。芪丹颗粒剂是由黄芪、丹参、川芎等中草药加 工提纯后的粗提取物制成的混合颗粒剂，辛洪涛等 〔6〕 应用中药治疗实验性大鼠肺纤维化 的临床研究结果显示芪丹颗粒剂对实验性大鼠肺纤维化的细胞因子TGF-β1、TNF- α表达 有抑制作用，辛洪涛等 〔7〕 用芪丹颗粒剂治疗肺纤维化临床效果较好。 纤维化形成是一个缓慢的动态过程，是一种进行性病变，涉及到细胞、细胞因子和组 织内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）等多种因素、多个环节间相互作用和相互调节 的复杂过程，最终结局是大量ECM沉积。纤维包括胶原纤维、网状纤维和弹力纤维。胶原 蛋白是ECM中最丰富的结构蛋白，是一类结构复杂的蛋白,主要分为I、II 、III 、Ⅳ和V 型。经免疫荧光法及免疫电镜所证实：胶原纤维主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白构成，网状纤 维主要由III 型胶原蛋白构成，网状纤维与胶原纤维在理化性状上有一定的差异,但都具有 典型呈64nm周期性横纹。网状纤维具有被银盐浸染的属性,故经银浸染后,网状纤维呈黑色, 故又称嗜银纤维(argyrophilicfiber),在常规H.E染色标本上不显网状纤维，故我们用嗜银染色 （Gomorri）方法来观察网织纤维。 本课题选取芪丹颗粒剂与汉防己甲素作为治疗用药, 芪丹1组和汉甲1组分别从造模后第2天 灌注芪丹颗粒剂和汉防己甲素,作为防治组；芪丹2组和汉甲2组分别从造模30天，早期矽肺 形成后灌注芪丹颗粒剂和汉防己甲素（用量同前） ，作为治疗组。羟脯氨酸主要存在于胶原 中，其他蛋白中含量很少，我们通过检测组织中的羟脯氨酸来反应胶原的含量。同时我们 通过采用连续切片，不同的病理染色方法来观察胶原纤维的组织学改变，结果显示芪丹颗 粒剂与汉防己甲素可抑制胶原蛋白的合成，但防治组与治疗组间无显著差异。各组肾组织 切片HE染色观察结果表明：模型组、芪丹组肾组织结构正常，汉甲组出现肾小管上皮细胞 的损伤,肾间质有炎细胞浸润，肾小球鲍氏囊中可见淡红色均质状蛋白性渗出物。 综上所述，芪丹颗粒剂具有延缓和减轻矽肺纤维化的作用，且无肾毒性。我们将在后 期实验中，进一步检测与肺纤维化密切相关的细胞因子及其基因水平，探讨芪丹颗粒剂防 治矽肺的分子机理。 参考文献： 1 梁淑荣，郑志仁，邹昌淇，等.尘肺病理图谱【M】北京：人民卫生出版社，1981 5 2 刘巨源，郭萍，周跃，等. 汉防己甲素对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞释放肿瘤坏死 因子的影响. Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) 2002; 37(5):613-615 3 何玉先，刘秉慈，缪庆，等. 汉防己甲素抑制矽肺胶原mRNA表达的研究.中华预 防医学杂志 1995;29（1）:18-20 4 齐恩华,赵文华,孙金英，等.应用维持剂量的汉防己甲素和羟基磷酸喹哌巩固矽肺治 疗效果的研究. 中国工业医学杂志 2001;14(1):43-44 5 赵俭，戴红，张一杰，等. 川芎嗪对博来霉素所致大鼠肺纤维化的保护作用研究. 解放军医学杂志 2005;30(5):23-25 6 辛洪涛、宋秀杰、徐少华，等.芪丹颗粒剂对大鼠肺间质纤维化时TGF-β和TGF-α 表 达的影响.首都医科大学学报.2004,25(1)：49-52. 7 辛洪涛, 刘庆华, 张欣,等. 芪丹颗粒剂治疗肺间质纤维化的临床研究. 山东医药, 2002,42(19)：20-21. 2.4 HE 染色结果 1 2 3 4 5 6 1、正常组大鼠肺组织HE 染色（×100） 2、模型组大鼠肺组织HE 染色（×100） 3、芪丹1组大鼠肺组织HE 染色（×100） 4、芪丹2组大鼠肺组织HE 染色（×100） 5、汉甲1组大鼠肺组织HE 染色（×100） 6 6、汉甲2组大鼠肺组织HE 染色（×100） 2.4 VG 染色结果 7 8 9 10 11 12 7、正常组大鼠肺组织VG 染色（×100） 8、模型组大鼠肺组织VG 染色（×100） 9、芪丹1组大鼠肺组织VG 染色（×100） 10、芪丹2组大鼠肺组织VG 染色（×100） 11、汉甲1组大鼠肺组织VG 染色（×100） 12、汉甲2组大鼠肺组织VG染色（×100） 2.5 Gomorri染色结果 13 14 7 15 16 17 18 13、正常组大鼠肺组织Gomorri 染色（×100） 14、模型组大鼠肺组织Gomorri 染色（×100） 15、芪丹1组大鼠肺组织Gomorri 染色（×100） 16、芪丹2组大鼠肺组织Gomorri 染色（×100） 17、汉甲1组大鼠肺组织Gomorri 染色（×100） 18、汉甲2组大鼠肺组织Gomorri染色（×100） 19 20 21 22 19、正常肾组织 HE 染色（×200 ） 20、21、.汉甲组,肾小管上皮细胞肿胀，变性 HE 染色（×200） 22、汉甲组,肾间质炎细胞浸润 HE 染色（×400）